目前市面上主要有的三种抗-Flag单克隆抗体是M1、M2和M5。M1单抗应用最早，必须在Ca2+的参与下才能和Flag抗原结合，并且只能特异识别位于N末端的Flag融合蛋白，其应用受到较大限制；M2单抗克服了M1依赖Ca2+的缺陷，可应用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白质；M5单抗多应用于类似N-Met-Flag-C的序列，是用于检测在细胞质表达的Flag融合蛋白质的首选抗体。
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Flag抗体的制备流程

单克隆抗体制备步骤及注意事项

合成完全抗原（以Flag与BSA的偶联为例）

  • 配制磷酸盐缓冲液：0.05M PB(pH7.4)、0.01M PBS(pH7.4)；
  • 准确称量Flag 4mg，溶于0.5mL双蒸水中；
  • 按照Flag与BSA的摩尔比为30:1确定BSA的量，称量9mg BSA后溶于0.5mL 0.05M PB(pH7.4)中；
  • 称量15mg EDC溶于0.5mL双蒸水中；
  • 将EDC溶解后滴入Flag与BSA的混合溶液中缓慢混合均匀，混匀后，在室温下摇床100rpm反应4h；
  • 4℃静置过夜；
  • 4℃条件下，用0.01mol/L、pH7.4的PBS透析72h，存储于-20℃备用。偶联后蛋白浓度的计算公式：蛋白浓度（mg/mL）=（1.45ⅹA280nm-0.74ⅹA260nm）ⅹ稀释浓度

间接ELISA检测

  • 包被：用包被缓冲液将完全抗原（Flag与载体蛋白偶联物）稀释到适当工作浓度，加入到酶标板的微孔中，每孔100μl，4℃过夜。用PBST洗涤5次，拍干；
  • 加待测样品：将样品适当稀释后，按顺序加入各孔，每孔100μL，同时设空白对照、阴性对照各一孔。37℃，孵育30min，洗涤，拍干；
  • 加酶标二抗HRP-IgG：先用酶标稀释液将HRP-IgG稀释到适当的工作浓度，再加入各孔中，每孔100μL，37℃，孵育30min，然后洗涤，拍干；
  • 加底物显色：每孔加入显色剂A50μL，加完后，再加入显色剂B50μl，混匀后开始计时，37℃孵育20min。终止反应：每孔加终止液(2mol/L H2SO4)50μl；
  • 酶标仪测450nm波长处各孔的吸光度，选取630nm波长处的吸光度作为参比；
  • 结果判定：阳性阈值（cut-off值）=2.1×阴性（平均值），阴性平均值不足0.05按0.05计算，大于阳性阈值的判为阳性，小于阳性阈值则判为阴性。

    • ②棋盘滴定法确定包被抗原工作浓度

  • 用一系列包被抗原稀释度进行包被，洗涤，加样，阳性、阴性血清、空白对照各一孔，孵育，洗涤；
  • 加入工作浓度的酶标抗鼠IgG抗体，孵育，洗涤；
  • 加底物显色，终止反应后，测定吸光度值；
  • 选择阳性A值为0.8左右，阴性A值小于0.1的包被抗原工作浓度。

制备腹水Flag抗体

步骤流程：腹腔注射0.5mL液体石腊于BALB/c鼠；1～2周后腹腔注射0.5×106~1×106个杂交瘤细胞；接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用移液器将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10mL腹水。

腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/mL。腹水采集后，3000rpm离心5分钟，弃去上层油脂和下层细胞，用1.5mL离心管分装成1mL/支，于-20℃保存。

②腹水的纯化与保存（正辛酸-硫酸铵沉淀法）

  • 取腹水，4℃，12000rpm离心20min；
  • 弃上层油脂及下层沉淀，加入3倍体积的醋酸盐缓冲液（60mmol/L，pH4.3），再加入辛酸（25μL/mL），轻微振荡，混匀；
  • 4℃，12000rpm离心20min后过滤，弃沉淀，留上清；
  • 用1mol/L NaOH调pH为7.2；
  • 加入硫酸铵（0.277g/mL），振荡混匀30min，4℃，12000rpm离心20min；
  • 弃上清，将沉淀用适量0.02mol/L pH7.0的PBS悬起，转入透析袋中；
  • 4℃，0.01mol/L pH7.0的PBS透析，72h；
  • 4℃，12000rpm离心20min；
  • 弃沉淀，保留上清于-20℃。

Flag抗体的鉴定

纯化抗体纯度测定

由蛋白浓度的测定公式求得蛋白浓度：A280nm×1.45-A260nm×0.74=蛋白浓度（mg/mL）；

单抗纯化后，根据纯化前后体积，推算出腹水中蛋白含量。

单抗相对亲和力测定

  • 以合成的包被原400ng/孔包被酶标板，按行分别加入按一定浓度倍比稀释的纯化单抗，37℃温育30min，洗涤；加入酶标二抗，37℃温育30min，洗涤；加底物显色20min，加终止液终止反应，双波长扫描测定吸光值。
  • 以单抗浓度为横坐标，以所对应的OD值为纵坐标作图，根据反应曲线分析单克隆抗体的相对亲和力。
  • 以抗体浓度的对数值为横坐标，以所对应的OD值为纵坐标作图，得一曲线，取曲线上最大OD值的50%所对应的横坐标为该抗体的稀释度，算出该抗体总的稀释度后，计算亲和常数。亲和常数计算公式：亲和常数K=160000(抗体分子量)/抗体稀释度×抗体浓度(mg/ml)

参考文献

[1]王云龙,李忠信,李恒思等. Flag标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究[D].2010

[2]鲁凤民,李雅娟,庄辉. N-端加flag标签增加P21Cip1/WAF1蛋白质稳定性[J]. 2006

[3]詹万雷,崔东,郑文岭等. FLAG融合短肽在重组蛋白质纯化中的应用[J].生命的化学,2004