单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞（杂交瘤细胞的选择性培养）；第二次是进一步筛选产生特异性抗体的杂交瘤细胞（筛选阳性克隆进行克隆化）。

第一次筛选

在B细胞与瘤细胞融合的过程中，存在未融合的B细胞、未融合的瘤细胞、“B细胞-B细胞”型融合细胞、“瘤细胞-瘤细胞”型融合细胞、“B细胞-瘤细胞”型融合细胞（杂交瘤细胞）以及“B细胞-多个瘤细胞”型融合细胞等多种类型。细胞融合后，进行杂交瘤细胞的选择培养是第一次筛选的关键。普遍采用的是HAT选择性培养基。

HAT培养基成分

H：次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）：完成次黄嘌呤核苷酸的补救途径。

A：氨基蝶呤（Aminopterin，A）：叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径。

T：胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）：“核苷酸前体”，供细胞通过补救途径合成DNA。

HAT培养基的筛选原理

细胞DNA合成包括主要合成和补救合成两种途径。其中，主要合成是由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，再进一步由核苷酸合成DNA的途径。在此过程中，二氢叶酸还原酶作为重要的辅酶参与这一过程。

补救途径是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase，HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）将次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成相应核苷酸，再进一步合成DNA的途径，在此过程中HGPRT与TK两种酶缺一不可。

融合所用的瘤细胞是经毒性培养基筛选出的HGPRT缺陷型细胞株。其过程为：用8-氮鸟嘌呤对瘤细胞进行筛选，它可以参与DNA合成的补救途径，但是由此合成出来的DNA不能具备正常DNA的功能，因此这种细胞会死亡。存活下来的细胞都是不能进行补救途径合成DNA的瘤细胞。这种缺陷型的瘤细胞与B细胞进行融合，融合后的细胞则既能通过主要途径合成核苷酸，也能通过补救途径合成核苷酸。

HAT培养基的选择作用

  • 未融合的B细胞、B细胞-B细胞”型融合细胞：不能无限增殖，5～7天死亡。
  • “B细胞-多个瘤细胞”型融合细胞：不稳定，几乎不能存活。
  • 骨髓瘤细胞、“瘤细胞-瘤细胞”型融合细胞：合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因自身缺乏HGPRT，阻断了DNA补救合成途径，不能在HAT培养液中增殖，5～7天死亡。
  • 杂交瘤细胞：既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又能利用B细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤核苷酸并最终与T一起合成DNA，在体外长期生长繁殖。

第二次筛选

在单克隆抗体的生产过程中，由于B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体也有差异（包括特异性抗体分泌细胞、无关抗体分泌细胞与抗体非分泌细胞等）。因此必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆化——即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。

筛选分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法有直接接种法、有限稀释法、软琼脂培养法。其中最常用方法是有限稀释法。

有限稀释法

  • 制备饲养细胞层。
  • 调整杂交瘤细胞浓度。
  • 将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原性结合的培养孔为阳性孔。此时，阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，要继续进行有限稀释，一般需要重复3-4次，直至确保每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。

注意

  • 对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞应尽早进行克隆化，否则抗体分泌型细胞可能会被非抗体分泌型细胞所抑制，因为非抗体分泌型细胞的生长速度比抗体分泌型细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌型细胞丢失。
  • 即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

详细步骤参考 单克隆抗体制备步骤及注意事项