酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术之后发展起来的一种真核展示系统。酵母表面展示是将特定肽/蛋白质基因与酵母自身分泌到细胞外或定位在细胞壁上的基因融合，通常是a-凝集素(a-agglutinin)基因，利用酵母细胞作为展示颗粒，利用流式细胞仪定量筛选高亲和力的特定肽。该技术能够同时选择表型和编码基因。

酵母展示抗体库的特点

  1. 酵母展示抗体库原始容量的大小与筛选到的目的抗体的亲和力有关，尤其是利用天然抗体库筛选目的抗体。
  2. 酵母展示抗体库技术可以利用流式细胞仪进行大容量筛选。
  3. 酵母的转化效率低，约为大肠杆菌的1/10000。
  4. 酵母抗体库展示通过抗性选择来粗筛阳性克隆，当克隆抗性丢失时会使抗体库在筛选过程中阴性克隆过度增殖，从而干扰抗体库的筛选。

利用酵母展示抗体库筛选抗体的步骤

酵母展示重组载体的构建

  1. 设计引物，通过PCR方法扩增抗体基因片段。
  2. PCR产物和质粒按一定比例混合（通常PCR产物为质粒的4~10倍），16℃条件下过夜连接。

酵母转染与培养

  1. 酵母EBY100单菌落用YPD培养基在30℃培养箱中培养过夜。2次接种活化后用500ml培养基扩大培养。
  2. 4000r/min，4℃离心5min，收获细胞，80ml无菌水重悬。在重悬液中加入10ml 10×TE Buffer，混匀后再加入10×LiAc贮存液，30℃缓慢摇动45min，再加入2.5ml 1mol/L DTT，于30℃轻摇30min。
  3. 将重悬液用250ml冷水、30ml山梨醇溶液（1mol/L，4℃冷却）依次清洗，离心后弃上清。最后用0.5ml相同浓度的山梨醇溶液重悬菌体。
  4. 每50 μl菌体加入小于100ng的DNA，电击转化，加450μl山梨醇溶液重悬菌体，取少量菌液稀释涂板，30℃条件下培养72h，计算转化率。
  5. 分别接入含葡萄糖的YNB-CAA溶液中，30℃过夜培养至A600为3~4，4000r/min离心10min，收集细胞，用含半乳糖YNB-CAA调整细胞浓度至A600为0.5~1，30℃振荡培养，分别于0和48h时取样。

抗体库筛选

  1. 将诱导培养的细胞重悬于5ml PBS缓冲液中，加入终浓度为100nmol/L的抗原，25℃孵育30min，冰浴5~10min后。3000r/min离心10min，弃上清，然后用50ml缓冲液清洗3次。
  2. 用5ml缓冲液重悬细胞，冰浴10min，每隔一会轻摇数下。加入40ml缓冲液进行洗涤，离心后弃去上清，用50ml缓冲液重悬细胞沉淀，涡旋振荡。
  3. Miltenyi LS柱置于磁场，用3ml冰浴缓冲液冲洗，进行预处理。一次性加入7ml细胞悬液，在冲洗停止后，将Miltenyi LS柱从磁场中取出，然后立即放回，使物理结合于柱上的细胞通过。在柱重新置于磁场后，再加入7ml细胞悬液。重复“取出-放回”操作。
  4. 用3ml缓冲液洗柱子，保证所有残留细胞都被洗净。将Miltenyi LS柱从磁场中取出，然后放回，加入3ml缓冲液，重复该步骤。
  5. 将Miltenyi LS柱从磁场中取出，加入7ml缓冲液，用柱塞将所有的结合细胞推入15ml圆锥底试管。
  6. 离心细胞，按要求重悬细胞：a. 第一轮筛选产物：100ml选择缓冲液（青霉素/链霉素抗性）过夜培养，用葡萄糖抑制ScFv抗体的诱导表达。重复以上步骤进行二次筛选。b. 第二轮筛选产物：500ml缓冲液重悬，进行染色，以便进行流式细胞仪分选。
  7. 阳性细胞在含有抗性的5ml SD-CAA培养液中培养，30℃振荡培养。当培养物变得浑浊时，可以诱导ScFv的表达，进行第二轮筛选。
  8. 一般分选3轮后可得到明显与抗原结合的细胞。
  9. 将单个细胞克隆接种培养，进行抗原结合鉴定。阳性克隆进行测序，鉴定不同的ScFv抗体。

参考文献：

[1] Cho BK, Kieke MC, Boder ET, et al. A yeast surface display system for the discovery of ligands that trigger cell activation[J]. J Immunol Methods, 1998, (220):179-188.

[2] 沈倍奋,陈志南,刘民培,等. 重组抗体[M]. 北京：北京科学出版社，2005:90-92.